LAPORAN
PRAKTIKUM ENZIMOLOGI
SKRINING DAN UJI AKTIVITAS
ENZIM
Nama :
Diana Putri Hapsari
NIM :
M0410018
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2012
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Sekarang ini penggunaan enzim
sudah banyak digunakan dalam skala besar, akan tetapi tidak semua enzim dapat
diproduksi secara massal oleh makhluk hidup tersebut. Dalam beberapa tahun
terakhir, industri enzim telah berkembang sangat pesat dan sangat berperan
penting dalam dunia industri. Kesadaran masyarakat akan keadaan lingkungan
sekarang ini menjadikan enzim sebagai salah satu alternatif dalam menggantikan
proses kimiawi dalam bidang industri. Enzim bersifat biokatalisator yang
efisien, selektif, ekonomis, tidak beracun dan mampu mengkatalitis tanpa produk
samping dan ramah akan lingkungan. Aplikasi enzim dalam industri antara lain
dalam teknologi fermentasi, rekayasa genetika dan teknologi aplikasi enzim
lainnya yang menyebabkan penggunaan enzim semakin luas.
Enzim dapat dihasilkan oleh
tanaman, hewan maupun mikroorganisme. Enzim yang berasal dari tanaman atau
hewan memiliki kelemahan apabila dipergunakan atau diproduksi, karena jaringan
pada tanaman mengandung bahan yang berbahaya, seperti senyawa fenolik, faktor
fisiologi pada organisme yang membutuhkan waktu yang sangat lama dan adanya
inhibitor enzim. Maka dari itu skrining enzim merupakan hal yang dapat
dilakukan. Skrining enzim dapat menggunakan mikroorganisme untuk memproduksi
enzim dengan beberapa kelebihan yaitu mudah diproduksi dalam skala besar, waktu
produksi relatif pendek serta dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan
biaya yang relatif rendah.
B. Perumusan Masalah
1. Bagaimana membuat media LB-amilum untuk skrining metode
tetes?
2. Bagaimana cara membuat inokulum cair?
3. Bagaiamana melakukan skrining dengan metode tetes?
4. Bagaimana hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim?
5. Bagaimana cara untuk menguji aktivitas enzim dengan
menggunakan sentrifugasi dan spektrofotometer?
6. Sampel mana yang konsentrasinya paling tinggi dan yang
paling rendah?
C. Tujuan
1. Membuat LB-amilum skrining metode tetes
2. Membuat inokulum cair
3. Melakukan skrining dengan metode tetes
4. Mengetahui hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim
5. Menguji aktivasi enzim dengan menggunakan sentrifugasi (4oC)
dan spektrofotometer 540 nm
6. Mengetahui sampel mana yang memiliki konsentrasi paling
tinggi dan yang paling rendah
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
A. Skrining Enzim
Industri enzim sekarang sudah
berkembang pesat dan berperan penting dalam dunia industri. Pada kondisi
sekarang menjadikan enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan
proses kimiawi dalam bidang industri (Falch, 1991; Putri, 2012). Hal demikian
dikarenakan dari sifat enzim sebagai biokatalisator yang efisien, selektif, ekonomis,
tidak beracun dan mengkatalisis reaksi tanpa produk samping serta ramah
lingkungan (Manitto, 1992; Putri, 2012). Adanya mikroorganisme yang unggul
merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim (Putri, 2012).
Metode skrining efisien untuk
melacak adanya enzim-enzim pada suatu bakteri. Menurut Malik (2008), metode
skrining yang efisien untuk melacak enzim-enzim sukrase pada BAL (bakteri asam
laktat) penghasil EPS (eksopolisakarida) secara molekular dengan teknik polymerase
chain reactions (PCR) menggunakan primer-primer degenarate yang
dirancang berdasarkan sekuens homolog dari berbagai gen-gen penyandi GTF dari
berbagai BAL.
Aktivitas mikroba dalam
mendegradasi protein ditunjukkan dengan adanya zona halo (lingkaran
jernih) di sekitar koloni (Putri, 2012). Menurut Gupta (2003) dalam jurnal
Zusfahair (2009), koloni penghasil lipase yang memperlihatkan zona bening
diukur indeks lipolitiknya. Indeks lipolitik dinyatakan sebagai nisbah antara
diameter zona bening dengan diameter koloni. Isolat yang memiliki indeks
lipolitik terbesar dinamakan isolat potensial penghasil lipase.
B. Uji Aktivitas Enzim
Penentuan aktivitas enzim
secara kualitatif dengan menghitung luas zona bening (Baktir, 2005). Sedangkan
penentuan aktivitas enzim secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer.
Spektrofotometer yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis. Analisis kimia
bertujuan untuk mengetahui komposisi suatu zat atau campuran zat yang merupakan
informasi kualitatif mengenai ada atau tidaknya suatu unsur atau komponen dalam
contoh. Selain itu, untuk mengukur jumlah atau banyaknya unsur yang diteliti
atau dengan kata lain adalah untuk mengetahui data kualitatif, serta dapat
dipakai untuk menentukan struktur suatu zat (Triyati, 1985). Metode
spektrofotometri ultra-violet dan sinar tampak telah banyak diterapkan untuk
penetapan senyawa-senyawa organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan
senyawa dalam jumlah yang sangat kecil (Skoog, 1971; Triyati, 1985).
Kurva standar adalah standar
dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk
sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk
mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya
sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Nilai absorbansi sampel yang
berbeda dibuat kurva standar dengan menghitung persamaan garis antara
konsentrasi dengann absorbannya. Fungsi persamaan garis dari kurva standar
digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui
konsentrasinya (Rizkiany, 2011).
Sentrifugasi merupakan salah
satu proses penghilangan kotoran dalam refinasi yang bertujuan memisahkan massecuite
menjadi kristal gula dan molasses dengan melibatkan kerja dari mesin
sentrifugal. Prinsip dari proses sentrifugasi adalah putaran motor dan gaya
sentrifugal (Putri, 2009).
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Alat
1. Erlenmeyer 50 ml :
4 buah
2. Inkubator shaker :
2 buah
3. Petri dish :
10 buah
4. Mikropipet :
1 buah
5. Kamera :
1 buah
6. Jangka sorong :
1 buah
7. Freezer :
1 buah
8. Tabung eppendorf :
4 buah
9. Tabung reaksi :
10 buah
10. Gelas beker :
2 buah
11. Hot plate :
1 buah
12. Spektrofotometer :
1 set
13. Tissue/ kapas :
secukupnya
14. Alumunium foil :
secukupnya
15. Kain kasa :
secukupnya
16. Benang :
secukupnya
17. Ose :
1 buah
18. Erlenmeyer 250 ml :
3 buah
19. Erlenmeyer 100 ml :
2 buah
20. Spatula :
1 buah
21. Erlenmeyer 500 ml :
1 buah
B. Bahan
1. Fenol :
1 gram
2. Na sulfida :
0.25 gram
3. Isolat K11-5 : secukupnya
4. Iodin :
secukupnya
5. NaCl 1 N steril :
secukupnya
6. NaOH :
5 gram
7. Garam rochelle :
40 gram
8. Aquades :
± 880 ml
9. Amilum :
1 gram
10. LB-amilum :
200 ml
11. Alkohol :
secukupnya
12. Triptone : 4 gram
13. Yeast ekstrak :
2 gram
14. Amilum : 2 gram
15. NaCl :
13.7 gram
16. Agar :
2 gram
C. Cara Kerja
1. Membuat LA-amilum
a. Yeast ekstrak 1 gram, amilum 1 gram, NaCl 1 gram, agar 1
gram, triptone 2 gram ditimbang
b. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer
c. Ditambahkan 200 ml aquades
d. Disterilisasi
e. Di hari berikutnya dicek media tersebut apakah kontam atau
tidak, jika tidak kontam dapat digunakan skrining
2. Membuat LB-amilum
a. Ditimbang satu per satu, triptone 2 gram, yeast ekstrak 1 gram,
amilum 1 gram dan NaCl 1 gram
b. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan dengan
aquades sebanyak 200 ml
c. Dipanaskan dan distirer sampai bening
d. Kemudian di sterilisasi
3. Membuat inokulum
a. 10 ml LB-amilum yang sudah steril digores dengan 3 goresan
ose isolat K11-5
b. Kemudian diinkubator shaker
4. Membuat LB-amilum skrining dengan metode tetes
a. 20 ml LB-amilum yang sudah steril ditambahkan 1 goresan ose
isolat K11-5
b. Dituang ke dalam 4 erlenmeyer 50 ml, 2 erlenmeyer
diinkubator shaker pada suhu 37oC selama 12 jam dengan kecepatan 120
rpm sedangkan sisanya pada suhu 50oC selama 24 jam dengan kecepatan
120 rpm
5. Menuang inokulum 10%
a. Inokulum yang sudah dibuat diambil 2 ml dengan mikropipet
1000 μl
b. Dimasukkan masing-masing 2 ml ke dalam LB-amilum 37oC
(A) dan LB-amilum 50oC (B)
c. Di inkubator shaker kembali, yaitu inkubator shaker 1 dengan
kecepatan 120 rpm, suhu 37oC selama 24 jam dan inkubator shaker 2
dengan kecepatan 120 rpm, suhu 50oC selama 24 jam
6. Skrining dengan metode tetes
a. LB-amilum diambil dengan mikropipet 0,8 μl
b. Diteteskan dengan 3 titik pada media yang sudah ada di petri
dish
c. Ditunggu sekitar 15 menit sampai tetesan kering
d. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
7. Membuat NaCl 1 N steril
a. NaCl sebanyak 11.7 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer
b. Ditambahkan 200 ml aquades
c. Disterilisasi
8. Membuat larutan DNS
a. Dicampurkan 5 gram DNS, 1 gram fenol, 0.25 gram Na2S
dan 5 gram NaOH ke dalam erlenmeyer 500 ml
b. Ditambahkan 300 ml aquades
c. Didiamkan selama 24 jam, kemudian disaring
9. Membuat larutan garam rochelle
a. Garam rochelle 40 gram ditambahkan 80 ml aquades
b. Diaduk sampai larut
10. Membuat larutan amilum 1%
a. 1 gram amilum ditambahkan dengan 100 ml aquades
b. Diaduk sampai larut
11. Mengukur zona bening
a. Iodin diteteskan sampai rata pada media yang sudah terdapat
koloninya
b. Didiamkan selama 10 menit
c. Dibilas atau dicuci dengan NaCl 1 N steril
d. Difoto zona bening yang terbentuk
12. Membuat larutan blangko
a. 0.5 ml aquades ditambahkan dengan 0.5 ml amilum 1%
b. Ditambahkan 2 ml DNS
c. Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit
13. Menguji aktivitas enzim
a. LB-amilum A dan B dimasukkan ke dalam tabung eppendorf
b. Disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan
3000 rpm dalam waktu 10 menit
c. Cairan diambil sebanyak 0.5 ml
d. Ditambahkan 0.5 ml amilum 1% dan 2 ml DNS
e. Diinkubasi shaker pada suhu 50oC dengan kecepatan
0 rpm selama 15 menit
f. Dimasukkan ke dalam air mendidih sekitar 5 menit
g. Dimasukkan ke dalam air dingin
h. Ditambahkan 1 ml garam rochelle
i.
Dilakukan
spektrofotometer pada 540 nm
14. Membuat larutan stok glukosa
a. 10 ml glukosa ditambah dengan 10 ml aquades ke dalam
erlenmeyer 50 ml
b. Dicampur sampai merata
15. Membuat larutan standar
a. Setiap tabung reaksi diberi nomor 1-5
b. Pada tabung no.1 dengan konsentrasi 0.2, diberi larutan stok
100 μl, ditambahkan 400 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml
DNS
c. Pada tabung no.2 dengan konsentrasi 0.4, diberi larutan stok
200 μl, ditambahkan 300 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml
DNS
d. Pada tabung no.3 dengan konsentrasi 0.6, diberi larutan stok
300 μl, ditambahkan 200 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml
DNS
e. Pada tabung no.4 dengan konsentrasi 0.8, diberi larutan stok
400 μl, ditambahkan 100 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml
DNS
f. Pada tabung no.5 dengan konsentrasi 1, diberi larutan stok
500 μl, ditambahkan 0 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml
DNS
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. HASIL PENELITIAN
1. Pengukuran Zona Bening
Petri dish
|
Diameter koloni
(cm)
|
Luas koloni (cm2)
|
Rata-rata La
|
Diameter zona
bening (cm)
|
Luas zona bening
(cm2)
|
Rata-rata Lb
|
Lb-La
|
||||||||
d1
|
d2
|
d3
|
L1
|
L2
|
L3
|
d1
|
d2
|
d3
|
L1
|
L2
|
L3
|
||||
n1
|
1,25
|
1,31
|
1
|
1,23
|
1,37
|
0,79
|
1,13
|
1,68
|
1,61
|
1,77
|
2,22
|
2,06
|
2,49
|
2,26
|
1,13
|
n2
|
1,11
|
1,07
|
1,24
|
0,95
|
0,92
|
1,21
|
1,03
|
1,51
|
1,45
|
1,45
|
1,81
|
1,67
|
1,67
|
1,72
|
0,69
|
n3
|
1,72
|
1,51
|
1,69
|
2,32
|
1,81
|
2,27
|
2,13
|
1,64
|
1,54
|
1,54
|
2,11
|
1,86
|
1,86
|
1,94
|
0,19
|
n4
|
1,15
|
0,92
|
1,14
|
1,06
|
0,66
|
1,02
|
0,91
|
1,63
|
1,37
|
1,65
|
2,11
|
1,49
|
2,16
|
1,92
|
1,01
|
n5
|
1,06
|
1,13
|
1
|
0,88
|
1,02
|
0,79
|
0,89
|
2
|
1,94
|
1,66
|
3,14
|
2,95
|
2,16
|
2,75
|
1,85
|
n6
|
1,53
|
1,6
|
1,6
|
1,86
|
2
|
2
|
1,95
|
1,67
|
1,52
|
1,63
|
2,22
|
1,81
|
2,11
|
2,05
|
0,09
|
n7
|
1,77
|
1,48
|
1,28
|
2,49
|
1,72
|
1,29
|
1,83
|
2,03
|
1,62
|
2,86
|
3,27
|
2,06
|
6,42
|
3,92
|
2,08
|
n8
|
1,68
|
1,51
|
1,36
|
2,22
|
1,81
|
1,45
|
1,83
|
1,79
|
1,54
|
1,64
|
2,49
|
1,86
|
2,11
|
2,15
|
0,33
|
n9
|
1,13
|
1,18
|
1,14
|
1,02
|
2,6
|
1,02
|
1,55
|
1,62
|
1,55
|
1,6
|
2,06
|
1,91
|
2,01
|
1,99
|
0,45
|
n3=
|-0,19| = 0,19
2. Hasil Absorbansi Kontrol dan Sampel pada Suhu 37oC
dan 50oC
A1
|
A2
|
A3
|
|
Kontrol A (37°)
|
0,5401
|
0,5401
|
0,5402
|
Kontrol A (50°)
|
1,0744
|
1,0740
|
1,0733
|
Kontrol B (37°)
|
0,5066
|
0,5064
|
0,5068
|
Kontrol B (50°)
|
0,7368
|
0,7377
|
0,7361
|
Sample A (37°)
|
0,5888
|
0,5890
|
0,5896
|
Sample A (50°)
|
1,1653
|
1,1658
|
1,1658
|
Sample B (37°)
|
0,5679
|
0,5679
|
0,5678
|
Sample B (50°)
|
1,0538
|
1,0553
|
1,0546
|
3. Hasil Absorbansi Sampel
Sample
|
Absorbansi 1
|
Absorbansi 2
|
Absorbansi 3
|
Rata-rata
|
S1
|
0,3993
|
0,3993
|
0,3992
|
0,3993
|
S2
|
0,6976
|
0,6973
|
0,6972
|
0,6974
|
S3
|
0,9063
|
0,9065
|
0,9065
|
0,9064
|
S4
|
1,1416
|
1,1418
|
1,1414
|
1,1416
|
S5
|
1,3558
|
1,357
|
1,3574
|
1,3567
|
B n1 40° C
|
0,4384
|
0,438
|
0,4381
|
0,4382
|
B n2 40° C
|
0,4227
|
0,4222
|
0,4223
|
0,4224
|
B n1 30° C
|
0,4604
|
0,4597
|
0,4602
|
0,4601
|
B n2 30° C
|
0,4333
|
0,4336
|
0,4335
|
0,4335
|
B n1 50° C
|
0,5735
|
0,5732
|
0,5728
|
0,5732
|
B n2 50° C
|
0,5719
|
0,5718
|
0,5718
|
0,5718
|
B n1 60° C
|
0,5448
|
0,5435
|
0,543
|
0,5438
|
B n2 60° C
|
0,5587
|
0,5575
|
0,5577
|
0,5579
|
4. Konsentrasi Sampel
Sampel
|
Absorbansi rata-rata
|
Konsentrasi sampel
|
S1
|
0,3993
|
0,1751
|
S2
|
0,6974
|
0,428
|
S3
|
0,9064
|
0,6053
|
S4
|
1,1416
|
0,8049
|
S5
|
1,3567
|
0,9874
|
B. PEMBAHASAN
1. Skrining Enzim
a. Pembuatan media amilum untuk skrining
Media yang digunakan adalah
media amilum dengan cara pembuatan yang pertama adalah memasukkan semua bahan
yaitu 1 gram yeast ekstrak, 1 gram NaCl, 2 gram tripton, 1 gram amilum dan 2
gram agar yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml. Kemudian diencerkan
dengan aquades sebanyak 200 ml. Dipanaskan dan distrirer pada suhu sekitar 300oC
sampai semua terlarut. Disimpan di dalam freezer, setelah sekitar 24 jam lalu
dilakukan penuangan media pada 10 petri dish. Penuangan dilakukan dalam ruang
laminar agar tetap steril. Setelah itu bungkus semua petri dish dengan kertas,
yang kemudian disimpan dalam inkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, maka media
sudah dapat digunakan untuk skrining.
b. Pembuatan inokulum
Awalnya dibuat media LB-Amilum
dengan cara memasukkan 2 gram tripton, 1 gram yeast ekstrak, 1 gram amilum dan
1 gram NaCl yang dilarutkan dengan aquades sebanyak 200 ml. Dipanaskan serta
distirer pada suhu sekitar 300oC sampai semua larut. Setelah itu,
masukkan ke dalam 4 buah erlenmeyer 50 ml dan dilakukan sterilisasi.
c. Pembuatan inokulum
Dengan memasukkan 10 ml
LB-Amilum yang sudah disiterilkan ke dalam erlenmeyer. Lalu ditambahkan 3 gores
ose isolat K11-5, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator
shaker selama 12 jam, suhu 37oC, dan kecepatan 120 rpm.
d. Pembuatan media LB-Amilum untuk skrining metode tetes
Dengan cara memasukkan 20 ml
LB-amilum yang sudah disterilkan ke dalam erlenmeyer. Setelah itu, ditambahkan
1 gores ose isolat K11-5. Lalu dimasukkan ke dalam
inkubator shaker selama 24 jam, dengan suhu 37oC dan kecepatan 120
rpm.
e. Inokulasi
Inokulasi dilakukan di dalam
laminar. Yang pertama dilakukan adalah mengambil inokulum yang sudah dibuat,
ambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet 1000 μl ke dalam 4
erlenmeyer. Pada 2 erlenmeyer (kelompok A) dimasukkan ke dalam inkubator shaker
I dimana dengan kecepatan 120 rpm, suhu 37oC dan selama 24 jam.
Sedangkan 2 erlenmeyer (kelompok B) dimasukkan ke dalam inkubator shaker II
dengan kecepatan 120 rpm, suhu 50oC dan selama 24 jam. Inkubator
dilakukan dengan perbedaan suhu yaitu 37oC dan 50oC
karena untuk mengetahui bagaimana pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim.
f. Skrining metode tetes
Metode tetes menggunakan ujung
tip mikropipet yang berukuran paling kecil, yaitu 2-20 μl. Dengan mengambil
LB-amilum dari inkubator shaker I setelah 24 jam. Dengan mikropipet diambil 0,8
μl LB-amilum, kemudian diteteskan 3 titik pada media petri dish. Tunggu sampai
15 menit sampai semua titik cukup kering. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam
dengan suhu 37oC.
g. Pengukuran zona bening
Mengambil skrining dari inkubator, kemudian
dilakukan pengukuran diameter koloni pada 3 titik dengan menggunakan jangka
sorong. Catat semua diameter yang diukur pada semua petri dish yang tidak
mengalami kontaminasi. Foto semua petri dish yang sudah diukur diameternya. Skrining
diwarnai dengan menggunakan iodin yang dituang sampai merata pada media.
Didiamkan selama 10 menit, lalu dibilas dengan larutan NaCl 1N steril. Setelah
itu, diukur zona bening yang terlihat. Kemudian catat zona bening dan foto
semua zona bening yang terbentuk. Larutan NaCl 1N steril dibuat dengan
mencampurkan NaCl sebanyak 11,7 gram dengan aquades 200 ml, kemudian
disterilisasi.
Skrining enzim merupakan upaya
mendeteksi atau mencari enzim tertentu di dalam makhluk hidup dengan
melaksanakan pemisahan. Pada percobaan ini melakukan skrining pada isolat K11-5
dengan medium LB-amilum. Skrining enzim pada percobaan ini menggunakan metode
tetes. Metode tetes merupakan metode yang menggunakan ujung tip mikropipet yang
terkecil (2-20 μl) dan isolat diteteskan pada medium agar.
Pengukuran zona bening untuk
mengetahui indeks katalitik yang dinyatakan sebagai nisbah antara diameter zona
bening dengan diameter koloni. Zona bening yang terbesar menunjukkan bahwa
banyak substrat dari medium yang dihidrolisis enzim bakteri tersebut. Dari data
pengukuran zona bening, didapatkan bahwa zona bening yang terluas adalah pada
n7 yaitu 2,08 cm2. Sehingga dapat dinyatakan bahwa bakteri pada n7
mampu menghidrolisis media berupa amilum dengan baik dari pada yang lain.
Sedangkan zona bening yang terkecil adalah n6 yaitu sekitar 0,09 cm2,
sehingga pada n6 kemampuan bakteri dalam menghidrolisis amilum kecil. Pada n3
didapatkan bahwa Lb-La hasilnya -0,19, ini berarti bahwa rata-rata diameter
koloni n3 lebih luas dari pada rata-rata diameter zona bening n3 yang
terbentuk.
Spektrofotometer merupakan
suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis
oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan
menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector fototube
(Chandra, 2012). Dalam percobaan kali ini menggunakan spektrofotometer UV-Vis
dimana sinar yang digunakan adalah sinar UV dan cahaya tamapak atau sekarang
dijadikan satu dengan nama photodiode.
Sentrifugasi adalah metode yang
digunakan dalam mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya
sentrifugasi pada partikel-partikelnya. Prinsip pada sentrifugasi adalah objek
diputar secra horizontal pada jarak tertentu. Gaya yang menyebabkan
partikel-partikel menuju dinding tabung silinder (eppendorf) dan akan
terakumulasi membentuk endapan (Zulfikar, 2011). Sentrifugasi ini dilakukan
pada suhu 4oC dengan kecepatan 3000 rpm, sehingga sentrifugasi ini
disebut dengan sentrifugasi dingin.
2. Uji Aktivitas Enzim
a. Pembuatan reagen-reagen
·
Larutan DNS
(3,5-dinitrosalicylic acid): Dengan mencampurkan 5 gram DNS, 1 gram fenol, 0.25
gram Na Sulfida (Na2S)/ Na bisulfat (Na2CO3)
dan 5 gram NaOH ke dalam erlenmeyer 500 ml. Kemudian ditambahkan 300 ml dan
diaduk sampai rata. Didiamkan selama 24 jam, setelah 24 jam larutan DNS lalu
disaring dan sudah bisa digunakan.
·
Larutan garam rochelle
(kalium natrium tartrat-4-hydrat) 40%: memasukkan garam rochelle sebanyak 40
gram, kemudian ditambahkan 80 ml aquades. Diaduk sampai garam rochelle larut .
·
Larutan amilum 1%:
menambahkan 1 gram amilum dengan 100 ml aquades, kemudian diaduk sampai rata.
Fungsi penambahan beberapa
reagen-reagen dalam uji aktivitas enzim:
Ø
DNS: dapat menyerap
dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik.
Ø
Iodin: iodin disini
berfungsi sebagai pewarna agar zona bening semakin jelas dan mudah untuk
diukur.
Ø
NaCl 1N steril:
berfungsi untuk membersihkan dan membilas pewarna iodin serta menghilangkan
koloni isolat K11-5 dari media.
Ø
Garam rochelle: untuk
menahan pH agar warna yang ditimbulkan tetap stabil.
Ø
Larutan blangko: untuk
kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri.
Ø
Larutan standar: untuk
menganalisa larutan sampel yang tidak diketahui.
b. Uji aktivitas sample
LB-amilum kelompok A dan
kelompok B masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 45 ml diusahakan
jumlah yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf semua sama agar saat dilakukan
sentrifugasi dingin dapat berputar dengan seimbang. Kemudian lakukan
sentrifugasi dengan suhu 4oC, kecepatan 3000 rpm dalam waktu 10
menit. Setelah itu akan dihasilkan 2 bentuk, yaitu cairan dan endapan. Diambil
cairannya sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu diinkubasi di
inkubator shaker dengan suhu 50oC, kecepatan 0 rpm selama 15 menit.
Setelah 15 menit, ditambahkan DNS sebanyak 2 ml, 0,5 ml aquades dan 0,5 ml
amilum 1%, lalu dimasukkan ke dalam air mendidih sekitar 5 menit. Setelah itu,
didinginkan dengan dimasukkan ke dalam air dingin, kemudian ditambahkan garam
rochelle sebanyak 1 ml. Lalu diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer
dengan panjang gelombang sebesar 540 nm.
Membuat larutan blangko yang
akan digunakan untuk kalibrasi pada pengukuran sampel maupun standar, yaitu
dengan mencampur 10 ml aquades, 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS, lalu dimasukkan ke
dalam air mendidih selama 5 menit. Membuat larutan stok glukosa dengan
mencampur 10 mg glukosa dengan 10 ml aquades yang dimasukkan ke dalam
erlenmeyer 50 ml. Membuat larutan standar sebanyak 5 tabung reaksi dengan
setiap tabung reaksi berbeda takarannya. Pada tabung reaksi 1, dibuat
konsentrasi 0.2, 100 μl larutan stok, 400 μl aquades. Pada tabung reaksi 2,
dibuat konsentrasi 0.4, 200 μl larutan stok dan 300 μl aquades. Pada tabung
reaksi 3, dibuat konsentrasi 0.6, 300 μl larutan stok dan 200 μl aquades. Pada
tabung reaksi 3, dibuat konsentrasi 0.8, 400 μl larutan stok dan 100 μl
aquades. Pada tabung reaksi 5, dibuat konsentrasi 1, 500 μl larutan stok, 0 μl
qauades. Kemudian semua larutan standar ini diperlakukan sama, yaitu diberi 0.5
ml aquades, 0.5 amilum 1% dan 2 ml DNS. Kemudian semua sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
Kurva
standar diperlukan untuk menentukan konsentrasi dari larutan sampel yang
absorbansinya telah diketahui. Dari kurva standar didapatkan persamaan kurva
standar yaitu y= 1,1785x + 0,193 dengan R2= 0,9959. Sehingga
konsentrasi sampel yang terbanyak adalah pada S5 dengan konsentrasi sebanyak
0,9874 sedangkan konsentrasi yang paling sedikit adalah pada S1 dengan
konsentrasi sebanyak 0,1751. Dari R2= 0,9959 dapat diketahui bahwa
nilai presisi dari percobaan ini sebesar 99,59%.
BAB V
KESIMPULAN
1. Membuat medium LB-amilum untuk skrining metode tetes yang
pertama adalah memasukkan 20 ml LB-amilum yang sudah disterilkan ke dalam
erlenmeyer. LB-amilum dibuat dengan mencampur 2 gr triptone, 1 gr yeast
ekstrak, 1 gr amilum, 1 gr NaCl dan ditambahkan oleh 200 ml aquades. Setelah
itu tambahkan 1 gores ose isolat K11-5, lalu dimasukkan
ke dalam inkubator shaker selama 24 jam dengan suhu 37oC dan
kecepatan 120 rpm.
2. Membuat inokulum cair dengan cara memasukkan 10 ml LB-amilum
yang sudah disterilkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 3 gores ose
isolat K11-5, lalu dimasukkan ke dalam inkubator shaker
selama 12 jam, suhu 37oC dan kecepatan 120 rpm.
3. Skrining dengan metode tetes dengan menggunakan ujung tip
mikropipet yang berukuran paling kecil, yaitu 2-20 μl. Dengan mengambil
LB-amilum dari inkubator shaker I setelah 24 jam. Dengan mikropipet diambil 0,8
μl LB-amilum, kemudian diteteskan 3 titik pada media petri dish. Tunggu sampai
15 menit sampai semua titik cukup kering. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam
dengan suhu 37oC.
4. Hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim adalah
semakin luas zona bening yang terbentuk, maka semakin tinggi aktivitas enzim
dalam mendegradasi media yang tersedia. Dan semakin sempit zona bening yang
terbentuk maka semakin rendah aktivitas enzim dalam mendegradasi media.
5. LB-amilum masing-masing dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf, kemudian disentrifugasi dingin pada suhu 4oC, kecepatan
3000 rpm dalam waktu 10 menit. Akan terbentuk 2 cairan dan endapan, kemudian
ambil cairannya ke dalam tabung reaksi dan diinkubator selama 15 menit, setelah
itu dimasukkan 2 ml DNS, 0,5 ml aquades dan 0,5 ml amilum 1% kemudian
dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit, lalu ditambahkan 1 ml garam
rochelle. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer 540 nm.
Membuat larutan blangko untuk kalibrasi pada pengukuran sampel maupun standar.
Membuat larutan standar sebanyak 5 takaran. Kemudian dimasukkan 2 ml DNS, 0,5
ml aquades, 0,5 ml amilum 1%, setelah itu semua sampel diukur absorbansinya
dengan spektrofotometer 540 nm.
6. Konsentrasi sampel yang paling tinggi dikandung oleh S5
dengan konsentrasi 0,9874 dan yang paling kecil adalah S1 dengan konsentrasi
0,1751.
DAFTAR PUSTAKA
Baktir, Afaf, Zumrotul Koiriyah
dan Ali Rohman. 2005. A Thermophilic Microbe Producing Dextranase from Heated
Sugar Cane (Mikroba Termofil Penghasil Dekstranase dari Nira Panas). Indo.
J. Chem, 5 (3): 224-227.
Malik, Amarila, Donna M.
Ariestanti, Anandayu Nurfachtiyani dan Arry Yanuar. 2008. Skrining Gen Glukosiltransferase
(GTF) dari Bakteri Asam Laktat Penghasil Eksopolisakarida. MAKARA,
12 (1): 1-6.
Putri, Ratna Ika, Mila Fauziyah
dan Agus Setiawan. 2009. Penerapan Kontroler Neural Fuzzy Untuk Pengendalian
Kecepatan Motor Induksi 3 Fasa pada Mesin Sentrifugal. INKOM, III (1-2).
Putri, Yunita Silvia. 2012.
Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah Pemotongan
Hewan. Surabaya: Universitas Airlangga.
Rizkiany,
Hilda Nur.2011. http://hildan09.student.ipb.ac.id/ [26 desember 2012]
Triyati, Etty. 1985.
Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak Serta Aplikasinya dalam
Oseonologi. Oseana, X (1): 39-47.
Zulfikar.
2011. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia-kesehatan/pemisahan-kimia-dan-analisis/sentrifugasi/
[26 desember 2012]
Zusfahair, Tien Setyaningtyas
dan Amin Fatoni. 2009. Isolasi, Pemurnian dan Karakteristik Lipase Bakteri
Hasil Skrining dari Tanah Tempat Pembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas. Jurnal
Natur Indonesia, 12 (2): 124-129.
(maaf belum bisa memasukkan gambar kurva standar karena ada sedikit gangguan di blog saya)
LAMPIRAN
Kurva Standar
·
Sampel
Tidak ada komentar:
Posting Komentar