What's Your Number? Check This Out

Kamis, 17 Januari 2013

TugasKu: Laporan Praktikum Enzimologi "Skrining dan Uji Aktivitas Enzim"

LAPORAN PRAKTIKUM ENZIMOLOGI
SKRINING DAN UJI AKTIVITAS ENZIM


               Nama          : Diana Putri Hapsari
               NIM                        : M0410018






JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2012


BAB I
PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang
Sekarang ini penggunaan enzim sudah banyak digunakan dalam skala besar, akan tetapi tidak semua enzim dapat diproduksi secara massal oleh makhluk hidup tersebut. Dalam beberapa tahun terakhir, industri enzim telah berkembang sangat pesat dan sangat berperan penting dalam dunia industri. Kesadaran masyarakat akan keadaan lingkungan sekarang ini menjadikan enzim sebagai salah satu alternatif dalam menggantikan proses kimiawi dalam bidang industri. Enzim bersifat biokatalisator yang efisien, selektif, ekonomis, tidak beracun dan mampu mengkatalitis tanpa produk samping dan ramah akan lingkungan. Aplikasi enzim dalam industri antara lain dalam teknologi fermentasi, rekayasa genetika dan teknologi aplikasi enzim lainnya yang menyebabkan penggunaan enzim semakin luas.
Enzim dapat dihasilkan oleh tanaman, hewan maupun mikroorganisme. Enzim yang berasal dari tanaman atau hewan memiliki kelemahan apabila dipergunakan atau diproduksi, karena jaringan pada tanaman mengandung bahan yang berbahaya, seperti senyawa fenolik, faktor fisiologi pada organisme yang membutuhkan waktu yang sangat lama dan adanya inhibitor enzim. Maka dari itu skrining enzim merupakan hal yang dapat dilakukan. Skrining enzim dapat menggunakan mikroorganisme untuk memproduksi enzim dengan beberapa kelebihan yaitu mudah diproduksi dalam skala besar, waktu produksi relatif pendek serta dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan biaya yang relatif rendah.
B.     Perumusan Masalah
1.    Bagaimana membuat media LB-amilum untuk skrining metode tetes?
2.    Bagaimana cara membuat inokulum cair?
3.    Bagaiamana melakukan skrining dengan metode tetes?
4.    Bagaimana hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim?
5.    Bagaimana cara untuk menguji aktivitas enzim dengan menggunakan sentrifugasi dan spektrofotometer?
6.    Sampel mana yang konsentrasinya paling tinggi dan yang paling rendah?

C.     Tujuan
1.    Membuat LB-amilum skrining metode tetes
2.    Membuat inokulum cair
3.    Melakukan skrining dengan metode tetes
4.    Mengetahui hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim
5.    Menguji aktivasi enzim dengan menggunakan sentrifugasi (4oC) dan spektrofotometer 540 nm
6.    Mengetahui sampel mana yang memiliki konsentrasi paling tinggi dan yang paling rendah


BAB II
KAJIAN PUSTAKA

A.    Skrining Enzim
Industri enzim sekarang sudah berkembang pesat dan berperan penting dalam dunia industri. Pada kondisi sekarang menjadikan enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan proses kimiawi dalam bidang industri (Falch, 1991; Putri, 2012). Hal demikian dikarenakan dari sifat enzim sebagai biokatalisator yang efisien, selektif, ekonomis, tidak beracun dan mengkatalisis reaksi tanpa produk samping serta ramah lingkungan (Manitto, 1992; Putri, 2012). Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim (Putri, 2012).
Metode skrining efisien untuk melacak adanya enzim-enzim pada suatu bakteri. Menurut Malik (2008), metode skrining yang efisien untuk melacak enzim-enzim sukrase pada BAL (bakteri asam laktat) penghasil EPS (eksopolisakarida) secara molekular dengan teknik polymerase chain reactions (PCR) menggunakan primer-primer degenarate yang dirancang berdasarkan sekuens homolog dari berbagai gen-gen penyandi GTF dari berbagai BAL.
Aktivitas mikroba dalam mendegradasi protein ditunjukkan dengan adanya zona halo (lingkaran jernih) di sekitar koloni (Putri, 2012). Menurut Gupta (2003) dalam jurnal Zusfahair (2009), koloni penghasil lipase yang memperlihatkan zona bening diukur indeks lipolitiknya. Indeks lipolitik dinyatakan sebagai nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Isolat yang memiliki indeks lipolitik terbesar dinamakan isolat potensial penghasil lipase.

B.     Uji Aktivitas Enzim
Penentuan aktivitas enzim secara kualitatif dengan menghitung luas zona bening (Baktir, 2005). Sedangkan penentuan aktivitas enzim secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer. Spektrofotometer yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis. Analisis kimia bertujuan untuk mengetahui komposisi suatu zat atau campuran zat yang merupakan informasi kualitatif mengenai ada atau tidaknya suatu unsur atau komponen dalam contoh. Selain itu, untuk mengukur jumlah atau banyaknya unsur yang diteliti atau dengan kata lain adalah untuk mengetahui data kualitatif, serta dapat dipakai untuk menentukan struktur suatu zat (Triyati, 1985). Metode spektrofotometri ultra-violet dan sinar tampak telah banyak diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangat kecil (Skoog, 1971; Triyati, 1985).
Kurva standar adalah standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Nilai absorbansi sampel yang berbeda dibuat kurva standar dengan menghitung persamaan garis antara konsentrasi dengann absorbannya. Fungsi persamaan garis dari kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui konsentrasinya (Rizkiany, 2011).
Sentrifugasi merupakan salah satu proses penghilangan kotoran dalam refinasi yang bertujuan memisahkan massecuite menjadi kristal gula dan molasses dengan melibatkan kerja dari mesin sentrifugal. Prinsip dari proses sentrifugasi adalah putaran motor dan gaya sentrifugal (Putri, 2009).





BAB III
METODE PENELITIAN

A.    Alat
1.    Erlenmeyer 50 ml        : 4 buah
2.    Inkubator shaker         : 2 buah
3.    Petri dish                     : 10 buah
4.    Mikropipet                  : 1 buah
5.    Kamera                        : 1 buah
6.    Jangka sorong             : 1 buah
7.    Freezer                                    : 1 buah
8.    Tabung eppendorf       : 4 buah
9.    Tabung reaksi              : 10 buah
10.  Gelas beker                : 2 buah
11.  Hot plate                    : 1 buah
12.  Spektrofotometer       : 1 set
13.  Tissue/ kapas              : secukupnya
14.  Alumunium foil          : secukupnya
15.  Kain kasa                   : secukupnya
16.  Benang                       : secukupnya
17.  Ose                             : 1 buah
18.  Erlenmeyer 250 ml     : 3 buah
19.  Erlenmeyer 100 ml     : 2 buah
20.  Spatula                       : 1 buah
21.  Erlenmeyer 500 ml     : 1 buah

B.     Bahan
1.    Fenol                           : 1 gram
2.    Na sulfida                   : 0.25 gram
3.    Isolat K11-5                   : secukupnya
4.    Iodin                           : secukupnya
5.    NaCl 1 N steril            : secukupnya
6.    NaOH                         : 5 gram
7.    Garam rochelle            : 40 gram
8.    Aquades                      : ± 880 ml
9.    Amilum                       : 1 gram
10.  LB-amilum                 : 200 ml
11.  Alkohol                      : secukupnya
12.  Triptone                      : 4 gram
13.  Yeast ekstrak             : 2 gram
14.  Amilum                      : 2 gram
15.  NaCl                           : 13.7 gram
16.  Agar                           : 2 gram

C.     Cara Kerja
1.    Membuat LA-amilum
a.       Yeast ekstrak 1 gram, amilum 1 gram, NaCl 1 gram, agar 1 gram, triptone 2 gram ditimbang
b.      Dimasukkan ke dalam erlenmeyer
c.       Ditambahkan 200 ml aquades
d.      Disterilisasi
e.       Di hari berikutnya dicek media tersebut apakah kontam atau tidak, jika tidak kontam dapat digunakan skrining
2.    Membuat LB-amilum
a.       Ditimbang satu per satu, triptone 2 gram, yeast ekstrak 1 gram, amilum 1 gram dan NaCl 1 gram
b.      Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan dengan aquades sebanyak 200 ml
c.       Dipanaskan dan distirer sampai bening
d.      Kemudian di sterilisasi


3.    Membuat inokulum
a.       10 ml LB-amilum yang sudah steril digores dengan 3 goresan ose isolat K11-5
b.      Kemudian diinkubator shaker
4.    Membuat LB-amilum skrining dengan metode tetes
a.       20 ml LB-amilum yang sudah steril ditambahkan 1 goresan ose isolat K11-5
b.      Dituang ke dalam 4 erlenmeyer 50 ml, 2 erlenmeyer diinkubator shaker pada suhu 37oC selama 12 jam dengan kecepatan 120 rpm sedangkan sisanya pada suhu 50oC selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm
5.    Menuang inokulum 10%
a.       Inokulum yang sudah dibuat diambil 2 ml dengan mikropipet 1000 μl
b.      Dimasukkan masing-masing 2 ml ke dalam LB-amilum 37oC (A) dan LB-amilum 50oC (B)
c.       Di inkubator shaker kembali, yaitu inkubator shaker 1 dengan kecepatan 120 rpm, suhu 37oC selama 24 jam dan inkubator shaker 2 dengan kecepatan 120 rpm, suhu 50oC selama 24 jam
6.    Skrining dengan metode tetes
a.       LB-amilum diambil dengan mikropipet 0,8 μl
b.      Diteteskan dengan 3 titik pada media yang sudah ada di petri dish
c.       Ditunggu sekitar 15 menit sampai tetesan kering
d.      Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
7.    Membuat NaCl 1 N steril
a.       NaCl sebanyak 11.7 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer
b.      Ditambahkan 200 ml aquades
c.       Disterilisasi
8.    Membuat larutan DNS
a.       Dicampurkan 5 gram DNS, 1 gram fenol, 0.25 gram Na2S dan 5 gram NaOH ke dalam erlenmeyer 500 ml
b.      Ditambahkan 300 ml aquades
c.       Didiamkan selama 24 jam, kemudian disaring
9.    Membuat larutan garam rochelle
a.       Garam rochelle 40 gram ditambahkan 80 ml aquades
b.      Diaduk sampai larut
10.  Membuat larutan amilum 1%
a.       1 gram amilum ditambahkan dengan 100 ml aquades
b.      Diaduk sampai larut
11.  Mengukur zona bening
a.       Iodin diteteskan sampai rata pada media yang sudah terdapat koloninya
b.      Didiamkan selama 10 menit
c.       Dibilas atau dicuci dengan NaCl 1 N steril
d.      Difoto zona bening yang terbentuk
12.  Membuat larutan blangko
a.       0.5 ml aquades ditambahkan dengan 0.5 ml amilum 1%
b.      Ditambahkan 2 ml DNS
c.       Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit
13.  Menguji aktivitas enzim
a.       LB-amilum A dan B dimasukkan ke dalam tabung eppendorf
b.      Disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 3000 rpm dalam waktu 10 menit
c.       Cairan diambil sebanyak 0.5 ml
d.      Ditambahkan 0.5 ml amilum 1% dan 2 ml DNS
e.       Diinkubasi shaker pada suhu 50oC dengan kecepatan 0 rpm selama 15 menit
f.       Dimasukkan ke dalam air mendidih sekitar 5 menit
g.      Dimasukkan ke dalam air dingin
h.      Ditambahkan 1 ml garam rochelle
i.        Dilakukan spektrofotometer pada 540 nm


14.  Membuat larutan stok glukosa
a.       10 ml glukosa ditambah dengan 10 ml aquades ke dalam erlenmeyer 50 ml
b.      Dicampur sampai merata
15.  Membuat larutan standar
a.       Setiap tabung reaksi diberi nomor 1-5
b.      Pada tabung no.1 dengan konsentrasi 0.2, diberi larutan stok 100 μl, ditambahkan 400 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS
c.       Pada tabung no.2 dengan konsentrasi 0.4, diberi larutan stok 200 μl, ditambahkan 300 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS
d.      Pada tabung no.3 dengan konsentrasi 0.6, diberi larutan stok 300 μl, ditambahkan 200 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS
e.       Pada tabung no.4 dengan konsentrasi 0.8, diberi larutan stok 400 μl, ditambahkan 100 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS
f.       Pada tabung no.5 dengan konsentrasi 1, diberi larutan stok 500 μl, ditambahkan 0 μl, lalu ditambahkan lagi dengan 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS


BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A.    HASIL PENELITIAN
1.      Pengukuran Zona Bening
Petri dish
Diameter koloni (cm)
Luas koloni (cm2)
Rata-rata La
Diameter zona bening (cm)
Luas zona bening (cm2)
Rata-rata Lb
Lb-La
d1
d2
d3
L1
L2
L3
d1
d2
d3
L1
L2
L3
n1
1,25
1,31
1
1,23
1,37
0,79
1,13
1,68
1,61
1,77
2,22
2,06
2,49
2,26
1,13
n2
1,11
1,07
1,24
0,95
0,92
1,21
1,03
1,51
1,45
1,45
1,81
1,67
1,67
1,72
0,69
n3
1,72
1,51
1,69
2,32
1,81
2,27
2,13
1,64
1,54
1,54
2,11
1,86
1,86
1,94
0,19
n4
1,15
0,92
1,14
1,06
0,66
1,02
0,91
1,63
1,37
1,65
2,11
1,49
2,16
1,92
1,01
n5
1,06
1,13
1
0,88
1,02
0,79
0,89
2
1,94
1,66
3,14
2,95
2,16
2,75
1,85
n6
1,53
1,6
1,6
1,86
2
2
1,95
1,67
1,52
1,63
2,22
1,81
2,11
2,05
0,09
n7
1,77
1,48
1,28
2,49
1,72
1,29
1,83
2,03
1,62
2,86
3,27
2,06
6,42
3,92
2,08
n8
1,68
1,51
1,36
2,22
1,81
1,45
1,83
1,79
1,54
1,64
2,49
1,86
2,11
2,15
0,33
n9
1,13
1,18
1,14
1,02
2,6
1,02
1,55
1,62
1,55
1,6
2,06
1,91
2,01
1,99
0,45

n3= |-0,19| = 0,19

2.      Hasil Absorbansi Kontrol dan Sampel pada Suhu 37oC dan 50oC

A1
A2
A3
Kontrol A (37°)
0,5401
0,5401
0,5402
Kontrol A (50°)
1,0744
1,0740
1,0733
Kontrol B (37°)
0,5066
0,5064
0,5068
Kontrol B (50°)
0,7368
0,7377
0,7361
Sample A (37°)
0,5888
0,5890
0,5896
Sample A (50°)
1,1653
1,1658
1,1658
Sample B (37°)
0,5679
0,5679
0,5678
Sample B (50°)
1,0538
1,0553
1,0546



3.      Hasil Absorbansi Sampel
Sample
Absorbansi 1
Absorbansi 2
Absorbansi 3
Rata-rata
S1
0,3993
0,3993
0,3992
0,3993
S2
0,6976
0,6973
0,6972
0,6974
S3
0,9063
0,9065
0,9065
0,9064
S4
1,1416
1,1418
1,1414
1,1416
S5
1,3558
1,357
1,3574
1,3567
B n1 40° C
0,4384
0,438
0,4381
0,4382
B n2 40° C
0,4227
0,4222
0,4223
0,4224
B n1 30° C
0,4604
0,4597
0,4602
0,4601
B n2 30° C
0,4333
0,4336
0,4335
0,4335
B n1 50° C
0,5735
0,5732
0,5728
0,5732
B n2 50° C
0,5719
0,5718
0,5718
0,5718
B n1 60° C
0,5448
0,5435
0,543
0,5438
B n2 60° C
0,5587
0,5575
0,5577
0,5579

4.      Konsentrasi Sampel
Sampel
Absorbansi rata-rata
Konsentrasi sampel
S1
0,3993
0,1751
S2
0,6974
0,428
S3
0,9064
0,6053
S4
1,1416
0,8049
S5
1,3567
0,9874


B.     PEMBAHASAN
1.      Skrining Enzim
a.       Pembuatan media amilum untuk skrining
Media yang digunakan adalah media amilum dengan cara pembuatan yang pertama adalah memasukkan semua bahan yaitu 1 gram yeast ekstrak, 1 gram NaCl, 2 gram tripton, 1 gram amilum dan 2 gram agar yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml. Kemudian diencerkan dengan aquades sebanyak 200 ml. Dipanaskan dan distrirer pada suhu sekitar 300oC sampai semua terlarut. Disimpan di dalam freezer, setelah sekitar 24 jam lalu dilakukan penuangan media pada 10 petri dish. Penuangan dilakukan dalam ruang laminar agar tetap steril. Setelah itu bungkus semua petri dish dengan kertas, yang kemudian disimpan dalam inkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, maka media sudah dapat digunakan untuk skrining.
b.      Pembuatan inokulum
Awalnya dibuat media LB-Amilum dengan cara memasukkan 2 gram tripton, 1 gram yeast ekstrak, 1 gram amilum dan 1 gram NaCl yang dilarutkan dengan aquades sebanyak 200 ml. Dipanaskan serta distirer pada suhu sekitar 300oC sampai semua larut. Setelah itu, masukkan ke dalam 4 buah erlenmeyer 50 ml dan dilakukan sterilisasi.
c.       Pembuatan inokulum
Dengan memasukkan 10 ml LB-Amilum yang sudah disiterilkan ke dalam erlenmeyer. Lalu ditambahkan 3 gores ose isolat K11-5, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator shaker selama 12 jam, suhu 37oC, dan kecepatan 120 rpm.
d.      Pembuatan media LB-Amilum untuk skrining metode tetes
Dengan cara memasukkan 20 ml LB-amilum yang sudah disterilkan ke dalam erlenmeyer. Setelah itu, ditambahkan 1 gores ose isolat K11-5. Lalu dimasukkan ke dalam inkubator shaker selama 24 jam, dengan suhu 37oC dan kecepatan 120 rpm.
e.       Inokulasi
Inokulasi dilakukan di dalam laminar. Yang pertama dilakukan adalah mengambil inokulum yang sudah dibuat, ambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet 1000 μl ke dalam 4 erlenmeyer. Pada 2 erlenmeyer (kelompok A) dimasukkan ke dalam inkubator shaker I dimana dengan kecepatan 120 rpm, suhu 37oC dan selama 24 jam. Sedangkan 2 erlenmeyer (kelompok B) dimasukkan ke dalam inkubator shaker II dengan kecepatan 120 rpm, suhu 50oC dan selama 24 jam. Inkubator dilakukan dengan perbedaan suhu yaitu 37oC dan 50oC karena untuk mengetahui bagaimana pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim.
f.       Skrining metode tetes
Metode tetes menggunakan ujung tip mikropipet yang berukuran paling kecil, yaitu 2-20 μl. Dengan mengambil LB-amilum dari inkubator shaker I setelah 24 jam. Dengan mikropipet diambil 0,8 μl LB-amilum, kemudian diteteskan 3 titik pada media petri dish. Tunggu sampai 15 menit sampai semua titik cukup kering. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC.
g.      Pengukuran zona bening
Mengambil skrining dari inkubator, kemudian dilakukan pengukuran diameter koloni pada 3 titik dengan menggunakan jangka sorong. Catat semua diameter yang diukur pada semua petri dish yang tidak mengalami kontaminasi. Foto semua petri dish yang sudah diukur diameternya. Skrining diwarnai dengan menggunakan iodin yang dituang sampai merata pada media. Didiamkan selama 10 menit, lalu dibilas dengan larutan NaCl 1N steril. Setelah itu, diukur zona bening yang terlihat. Kemudian catat zona bening dan foto semua zona bening yang terbentuk. Larutan NaCl 1N steril dibuat dengan mencampurkan NaCl sebanyak 11,7 gram dengan aquades 200 ml, kemudian disterilisasi.
Skrining enzim merupakan upaya mendeteksi atau mencari enzim tertentu di dalam makhluk hidup dengan melaksanakan pemisahan. Pada percobaan ini melakukan skrining pada isolat K11-5 dengan medium LB-amilum. Skrining enzim pada percobaan ini menggunakan metode tetes. Metode tetes merupakan metode yang menggunakan ujung tip mikropipet yang terkecil (2-20 μl) dan isolat diteteskan pada medium agar.
Pengukuran zona bening untuk mengetahui indeks katalitik yang dinyatakan sebagai nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Zona bening yang terbesar menunjukkan bahwa banyak substrat dari medium yang dihidrolisis enzim bakteri tersebut. Dari data pengukuran zona bening, didapatkan bahwa zona bening yang terluas adalah pada n7 yaitu 2,08 cm2. Sehingga dapat dinyatakan bahwa bakteri pada n7 mampu menghidrolisis media berupa amilum dengan baik dari pada yang lain. Sedangkan zona bening yang terkecil adalah n6 yaitu sekitar 0,09 cm2, sehingga pada n6 kemampuan bakteri dalam menghidrolisis amilum kecil. Pada n3 didapatkan bahwa Lb-La hasilnya -0,19, ini berarti bahwa rata-rata diameter koloni n3 lebih luas dari pada rata-rata diameter zona bening n3 yang terbentuk.
Spektrofotometer merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector fototube (Chandra, 2012). Dalam percobaan kali ini menggunakan spektrofotometer UV-Vis dimana sinar yang digunakan adalah sinar UV dan cahaya tamapak atau sekarang dijadikan satu dengan nama photodiode.
Sentrifugasi adalah metode yang digunakan dalam mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya. Prinsip pada sentrifugasi adalah objek diputar secra horizontal pada jarak tertentu. Gaya yang menyebabkan partikel-partikel menuju dinding tabung silinder (eppendorf) dan akan terakumulasi membentuk endapan (Zulfikar, 2011). Sentrifugasi ini dilakukan pada suhu 4oC dengan kecepatan 3000 rpm, sehingga sentrifugasi ini disebut dengan sentrifugasi dingin.
2.      Uji Aktivitas Enzim
a.       Pembuatan reagen-reagen
·         Larutan DNS (3,5-dinitrosalicylic acid): Dengan mencampurkan 5 gram DNS, 1 gram fenol, 0.25 gram Na Sulfida (Na2S)/ Na bisulfat (Na2CO3) dan 5 gram NaOH ke dalam erlenmeyer 500 ml. Kemudian ditambahkan 300 ml dan diaduk sampai rata. Didiamkan selama 24 jam, setelah 24 jam larutan DNS lalu disaring dan sudah bisa digunakan.
·         Larutan garam rochelle (kalium natrium tartrat-4-hydrat) 40%: memasukkan garam rochelle sebanyak 40 gram, kemudian ditambahkan 80 ml aquades. Diaduk sampai garam rochelle larut .
·         Larutan amilum 1%: menambahkan 1 gram amilum dengan 100 ml aquades, kemudian diaduk sampai rata.
Fungsi penambahan beberapa reagen-reagen dalam uji aktivitas enzim:
Ø      DNS: dapat menyerap dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik.
Ø      Iodin: iodin disini berfungsi sebagai pewarna agar zona bening semakin jelas dan mudah untuk diukur.
Ø      NaCl 1N steril: berfungsi untuk membersihkan dan membilas pewarna iodin serta menghilangkan koloni isolat K11-5 dari media.
Ø      Garam rochelle: untuk menahan pH agar warna yang ditimbulkan tetap stabil.
Ø      Larutan blangko: untuk kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri.
Ø      Larutan standar: untuk menganalisa larutan sampel yang tidak diketahui.
b.      Uji aktivitas sample
LB-amilum kelompok A dan kelompok B masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 45 ml diusahakan jumlah yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf semua sama agar saat dilakukan sentrifugasi dingin dapat berputar dengan seimbang. Kemudian lakukan sentrifugasi dengan suhu 4oC, kecepatan 3000 rpm dalam waktu 10 menit. Setelah itu akan dihasilkan 2 bentuk, yaitu cairan dan endapan. Diambil cairannya sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu diinkubasi di inkubator shaker dengan suhu 50oC, kecepatan 0 rpm selama 15 menit. Setelah 15 menit, ditambahkan DNS sebanyak 2 ml, 0,5 ml aquades dan 0,5 ml amilum 1%, lalu dimasukkan ke dalam air mendidih sekitar 5 menit. Setelah itu, didinginkan dengan dimasukkan ke dalam air dingin, kemudian ditambahkan garam rochelle sebanyak 1 ml. Lalu diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang sebesar 540 nm.
Membuat larutan blangko yang akan digunakan untuk kalibrasi pada pengukuran sampel maupun standar, yaitu dengan mencampur 10 ml aquades, 0.5 ml amilum 1%, 2 ml DNS, lalu dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit. Membuat larutan stok glukosa dengan mencampur 10 mg glukosa dengan 10 ml aquades yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 ml. Membuat larutan standar sebanyak 5 tabung reaksi dengan setiap tabung reaksi berbeda takarannya. Pada tabung reaksi 1, dibuat konsentrasi 0.2, 100 μl larutan stok, 400 μl aquades. Pada tabung reaksi 2, dibuat konsentrasi 0.4, 200 μl larutan stok dan 300 μl aquades. Pada tabung reaksi 3, dibuat konsentrasi 0.6, 300 μl larutan stok dan 200 μl aquades. Pada tabung reaksi 3, dibuat konsentrasi 0.8, 400 μl larutan stok dan 100 μl aquades. Pada tabung reaksi 5, dibuat konsentrasi 1, 500 μl larutan stok, 0 μl qauades. Kemudian semua larutan standar ini diperlakukan sama, yaitu diberi 0.5 ml aquades, 0.5 amilum 1% dan 2 ml DNS. Kemudian semua sampel diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
                        Kurva standar diperlukan untuk menentukan konsentrasi dari larutan sampel yang absorbansinya telah diketahui. Dari kurva standar didapatkan persamaan kurva standar yaitu y= 1,1785x + 0,193 dengan R2= 0,9959. Sehingga konsentrasi sampel yang terbanyak adalah pada S5 dengan konsentrasi sebanyak 0,9874 sedangkan konsentrasi yang paling sedikit adalah pada S1 dengan konsentrasi sebanyak 0,1751. Dari R2= 0,9959 dapat diketahui bahwa nilai presisi dari percobaan ini sebesar 99,59%.


BAB V
KESIMPULAN

1.      Membuat medium LB-amilum untuk skrining metode tetes yang pertama adalah memasukkan 20 ml LB-amilum yang sudah disterilkan ke dalam erlenmeyer. LB-amilum dibuat dengan mencampur 2 gr triptone, 1 gr yeast ekstrak, 1 gr amilum, 1 gr NaCl dan ditambahkan oleh 200 ml aquades. Setelah itu tambahkan 1 gores ose isolat K11-5, lalu dimasukkan ke dalam inkubator shaker selama 24 jam dengan suhu 37oC dan kecepatan 120 rpm.
2.      Membuat inokulum cair dengan cara memasukkan 10 ml LB-amilum yang sudah disterilkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 3 gores ose isolat K11-5, lalu dimasukkan ke dalam inkubator shaker selama 12 jam, suhu 37oC dan kecepatan 120 rpm.
3.      Skrining dengan metode tetes dengan menggunakan ujung tip mikropipet yang berukuran paling kecil, yaitu 2-20 μl. Dengan mengambil LB-amilum dari inkubator shaker I setelah 24 jam. Dengan mikropipet diambil 0,8 μl LB-amilum, kemudian diteteskan 3 titik pada media petri dish. Tunggu sampai 15 menit sampai semua titik cukup kering. Setelah itu, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC.
4.      Hubungan luas zona bening dengan aktivitas enzim adalah semakin luas zona bening yang terbentuk, maka semakin tinggi aktivitas enzim dalam mendegradasi media yang tersedia. Dan semakin sempit zona bening yang terbentuk maka semakin rendah aktivitas enzim dalam mendegradasi media.
5.      LB-amilum masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian disentrifugasi dingin pada suhu 4oC, kecepatan 3000 rpm dalam waktu 10 menit. Akan terbentuk 2 cairan dan endapan, kemudian ambil cairannya ke dalam tabung reaksi dan diinkubator selama 15 menit, setelah itu dimasukkan 2 ml DNS, 0,5 ml aquades dan 0,5 ml amilum 1% kemudian dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit, lalu ditambahkan 1 ml garam rochelle. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer 540 nm. Membuat larutan blangko untuk kalibrasi pada pengukuran sampel maupun standar. Membuat larutan standar sebanyak 5 takaran. Kemudian dimasukkan 2 ml DNS, 0,5 ml aquades, 0,5 ml amilum 1%, setelah itu semua sampel diukur absorbansinya dengan spektrofotometer 540 nm.
6.      Konsentrasi sampel yang paling tinggi dikandung oleh S5 dengan konsentrasi 0,9874 dan yang paling kecil adalah S1 dengan konsentrasi 0,1751.


DAFTAR PUSTAKA

Baktir, Afaf, Zumrotul Koiriyah dan Ali Rohman. 2005. A Thermophilic Microbe Producing Dextranase from Heated Sugar Cane (Mikroba Termofil Penghasil Dekstranase dari Nira Panas). Indo. J. Chem, 5 (3): 224-227.
Malik, Amarila, Donna M. Ariestanti, Anandayu Nurfachtiyani dan Arry Yanuar. 2008. Skrining Gen Glukosiltransferase (GTF) dari Bakteri Asam Laktat Penghasil Eksopolisakarida. MAKARA, 12 (1): 1-6.
Putri, Ratna Ika, Mila Fauziyah dan Agus Setiawan. 2009. Penerapan Kontroler Neural Fuzzy Untuk Pengendalian Kecepatan Motor Induksi 3 Fasa pada Mesin Sentrifugal. INKOM, III (1-2).
Putri, Yunita Silvia. 2012. Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan. Surabaya: Universitas Airlangga.
Rizkiany, Hilda Nur.2011.  http://hildan09.student.ipb.ac.id/  [26 desember 2012]
Triyati, Etty. 1985. Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak Serta Aplikasinya dalam Oseonologi. Oseana, X (1): 39-47.
Zusfahair, Tien Setyaningtyas dan Amin Fatoni. 2009. Isolasi, Pemurnian dan Karakteristik Lipase Bakteri Hasil Skrining dari Tanah Tempat Pembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas. Jurnal Natur Indonesia, 12 (2): 124-129.


LAMPIRAN
Kurva Standar
·         Sampel
(maaf belum bisa memasukkan gambar kurva standar karena ada sedikit gangguan di blog saya)